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为什么QB microRNA技术和产品比ABI、SBI的同类产品好?

采用qPCR技术对microRNA进行定量检测的方法主要有三种,QB采用加PolyA尾与SYBR染料三步法进行定量检测,主要特点在于:

(1) 加入PolyA尾能有效避免由于microRNA3’端由于不同亚型导致茎环引物连接不上的问题;

(2)QB荧光定量末端引物采用长短引物以最优比例混合搭配,既能保证PCR扩增的灵敏度,也能保证PCR的特异性;

(3)引入旷博特异的外缘参照物,能准确监控加尾,逆转录效率,并检测由于内参不能稳定存在的U1或U6的血清血浆样本

(4)与探针法相比,由于原理的不一样,PCR过程中,一个PCR拷贝所携带的探针荧光为一个光源,而SYBR由于镶合在碱基之间,在保证特异性一致的前提下,灵敏度将高于探针法,易于检测。

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为什么研究microRNA?

microRNA 是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控,易于调控。且microRNA具有以下特点,可作为生物标志物:

①细胞特异性:不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同;

②“时空”特异性:细胞在不同发育阶段,microRNA组成不同;

③保守性:不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能;

④稳定性高:microRNA在PH改变,DNA以及RNA裂解酶的作用下,不易降解,具有很高的稳定性。

因此microRNA是作为优秀的生物标志物,能作为调控生物信号通路的重要小分子。


microRNA技术和产品可以用于什么样的样本?

microRNA技术和产品可以用于细胞、组织、血清及血浆样本。

用于microRNA检测的样本如何收集?如何保存?如何运输?

细胞、冰冻组织、血清及血浆均-80℃保存及运输;石蜡组织常温保存及运输。

一次microRNA检测样本的需要量是多少?

细胞样本:1×107个;组织样本:50mg;血清及血浆样本:2ml ;


QB microRNA技术平台和产品的优势是什么?

1.独特设计的三步法:由于在DNA转录过程中,microRNA的3’端序列产生的多样化现象,使得目前市场上qPCR两步法检测的准确性受到很大影响。而QB自主创新的三步检测法可以很好地避免这种缺陷,极大地提高了检测的准确性。

2.精心设计的正/反向引物:与市场上其他三步法同类产品不同,QB为每一个microRNA都精心设计了独特的Universal Tag和正/反向引物,此外反向引物还采取了双引物混搭的特殊设计。这些独特的设计极大地提高了反应的特异性和敏感性。

3.外源性参照物的使用:QB  microRNA高通量qPCR技术在使用传统U1/U6内源参照的同时引入了特制的外源参照物。通过使用外源参照物可以对血清、血浆样本的RNA提取和反转录质量进行监控,并且可以对样本中microRNA的表达量进行精确定量。


QB的microRNA技术和产品能否用于发现新的microRNA?

不能,QB microRNA技术和产品均是针对已知序列的microRNA进行研究的。

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为什么要用U1或U6?

qPCR是检测低丰度miRNA的敏感方法,为了去除不同标本在miRNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别而获得目标基因特异性表达的真正差异,通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。内参扩增中的变化可以反映miRNA产量、质量和/或cDNA合成效率的变化,所以选择适当的内参基因以减少检测标本间的差异是必须的。

选择U1,U6的原因有:①组成型表达稳定;②在细胞内存在水平适度;③在不同类型的细胞和组织(如正常细胞和癌细胞)含量稳定,无显著性差别;④与细胞周期以及细胞是否活化无关;⑤不受任何内源性或外源性因素的影响。


外源性内参照是什么?可用于什么样本的检测?

外源性参照主要用于基因芯片和定量实时PCR(QRT-PCR)为基础的基因表达,是指与需要分析检测样本中miRNA不同的miRNA。外源性miRNA参照在例如逆转录和标记等酶促反应之前加入,具有评估检测性能的的作用。可用于血清、血浆样本的检测。

前体能否用此技术检测?为什么检测不到?

前提不能用于此技术检测,由于前体存在茎环状,由于空间位阻存在,聚合酶无法与前体结合,无法进行PCR扩增。

QB microRNA技术平台和产品可用于什么研究?

1.免疫学应用(T/B淋巴细胞):QB独特设计的引物涵盖了绝大多数在免疫细胞中所发现的microRNA,通过使用QB高通量microRNAqPCR技术,可以同时准确地监测大量已知的microRNA在免疫反应中表达的变化,从而发现其在生理病理状态下的重要作用,此外,还可以发现和鉴定出新的生物标志物,达到监测免疫细胞的信号转导和组织器官的分化的目的。

2.干细胞领域的应用:使用高通量microRNA可以在较短时间内发现新的干细胞分化的标志microRNA,此外通过对已知的microRNA标志物表达量的检测,可以达到对干细胞的多能性以及分化进行监测的目的。

3.癌症领域的应用:①对肿瘤进行早期诊断;②对病人进行个体化治疗;③监控病人的预后;④寻找新的癌症治疗方法;⑤筛选新的抗癌药物。


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为什么MicroRNA可作为生物标志物?

microRNA 是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控。microRNA具有以下特点:

①细胞特异性:不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同;

②“时空”特异性:细胞在不同发育阶段,microRNA组成不同;

③保守性:不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能;

④稳定性高:microRNA在PH改变,DNA以及RNA裂解酶的作用下,不易降解,具有很高的稳定性。

因此microRNA是天然的优秀生物标志物


MicroRNA的主要作用和应用是什么?

MicroRNA是由约22个核苷酸组成的单链小RNA,广泛存在于真核生物细胞中,通过与靶mRNA的互补配对在转录后水平对基因表达进行调控,导致mRNA的降解或翻译抑制。miRNA与其靶mRNA分子组成一个复杂的调控网络,参与包括细胞增殖、凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种生物学过程。


我用你们的引物产品检测的结果不好,为什么?

QB生物的每一条microRNA的引物都是经过反复验证的,如果检测结果不好可能有多种原因:1.模板质量、浓度;2.反应体系;3.反应条件。

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我能否用文献上找到的引物直接使用贵公司的产品?

我们的技术是自主创新的三步法,与传统的茎-环反转录方式不同,引物是双引物混搭的独特设计,所以一般文献上的引物是不能应用的。

购买产品后,我需要准备什么?

我们的表达谱检测试剂盒试剂配备完全,您只要准备质量可靠的miRNA样本即可。

在使用QB microRNA产品时要注意些什么呢?

A、在操作中,应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性移液器吸头(带滤嘴自卸式),并不能用手直接触摸毛细管、离心管的底部。

B、在试剂准备和标本处理时应使用超净工作台(负压式)或防污染罩,以防止对环境的污染。

C、操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用10%次氯酸或75%乙醇擦拭消毒。每次实验前后用10%次氯酸和70%乙醇擦拭移液器、操作台。

D、实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应妥善放置,专人保管;废弃物应置专门容器中,妥善处理。

E、荧光探针应避光保存,加入反应液中后,应尽快配制好反应体系进行扩增。

F、配制反应体系时,应注意移液器的使用方法,所有的液体都要缓慢加至管底,不要加至管壁,所有液体的混匀要用振荡器进行,不能用移液器吹打,反应体系配制完毕后低速离心数秒,避免产生气泡。

G、配制反应体系过程中若需标记,请在试管架或离心机管架上标记,不要直接标记在离心管上。


为什么阳性对照一直没有扩增曲线?

☆反应成分;

☆反应条件;

☆模板是否降解;

☆体系问题:●镁离子浓度不对;●酶浓度不对等;●酶不工作;●探针不工作。

为什么阴性对照一直有扩增曲线出现?

◆反应mix或水被污染。

◆引物二聚体的出现。用SG法在35cycles以后阴性出现起飞属正常情况,可配合熔解曲线进行分析。

◆反应过程中探针的降解。用PAGE电泳对探针进行检测。

◆如果使用了ROX校正,则可能是ROX的降解所造成。

如果出现污染该怎么办?

1.更换试剂

更换新的试剂和水,用确保无污染的移液器分装备用。

2.清洁所有可能的污染源:实验台面、小离心机、冰箱门把手等等

1)实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸钠溶液擦拭清洁。

2)或者用10%漂白粉溶液擦拭。

3) 紫外光照射,照射距离应不超过90 cm,照射时间最好过夜。

实验过程中更加小心,采用前面提到的各种防止污染的办法。


何谓相对定量和绝对定量?

相对定量指在一定样本中靶序列相对于另一参照样本量的变化:标准曲线法;比较CT法

绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知样本的量。

何谓重复性?

重复性是判断实验结果优劣的重要指标,其主要判断指标为标准差(SD)和变异系数(CV)。

影响结果重复性较为关键的因素包括:

(1)PCR 反应扩增的效率;(2)目的基因的初始浓度;(3)标准曲线的影响;(4)加样的准确性;(5)仪器固定参数。


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何谓灵敏度?

PCR检测的最低拷贝数

影响实时定量PCR 敏感性的因素:

◆反应体系;◆Taq酶的活性;◆反应体系中形成的引物二聚体的影响;◆循环数;◆Mg2+的浓度。

CT值出现过晚的原因是什么?

扩增效率低,反应条件不够优化(设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等)。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR产物太长,一般采用80-150bp的产物长度。

无CT值(信号)出现的原因是什么?

反应循环数不够。

检测荧光信号的步骤有误。

引物或探针降解。

引物或探针的设计,如探针高于引物的温度不够,造成探针未杂交上而产物已延伸的情况。

模板量不足,对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

模板降解。

为什么标准曲线的线性关系不佳?

加样存在误差,使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解,应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳,重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物,或模板浓度过高。

溶解曲线不止一个主峰的原因是什么?

引物设计不够优化。应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

由于microRNA在生成时会在3端产生不同长短的亚型,导致溶解曲线不止一个主峰

镁离子浓度过高。适当降低镁离子浓度,或选择更合适的mix试剂盒。

模板有基因组的污染。RNA提取过程中避免DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

扩增效率低的原因是什么?

反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

反应条件不够优化,可适当降低退火温度或改为三步扩增法。

反应体系中有PCR反应抑制物。一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

实验重复性不好的原因是什么?

加样不准确。

仪器在样品上温度条件有差异,即温度均一性不好。

模板浓度低。样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。

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常用PCR荧光染料有哪些?

水解探针或Taqman探针;分子信标;Scorpions;杂交探针;SYBR Green I 。

基本参数的优化包括哪些?

MgCl2的浓度;模板的浓度;PCR抑制子;杂交探针的浓度;对照设置;引物的浓度。

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